Храм был построен в 1730-1736 гг. по проекту архитектора Килиана Игнаца Динценгофера, одного из лучших мастеров чешского барокко. Первоначально храм принадлежал Католической Церкви и был посвящен Карлу Боромейскому. При костеле действовал институт для престарелых ксендзов. 29 июля 1933 г. решением правительства Чехословацкой республики храм был передан Православной Церкви (Чешско-Моравской православной епархии, управлявшейся епископом-мучеником Гораздом и состоявшей в юрисдикции Сербской Церкви). Освящение храма состоялось 28 сентября 1935 г. в день памяти святого Вацлава (Вячеслава) Чешского. В освящении приняли участие епископы Досифей, Сергий, Дамаскин и Горазд. Иконостас храма был создан югославским художником Святославом Вуковичем по проекту профессора В.А.Брандта. От Болгарской Православной Церкви храму была подарена икона святых равноапостольных Кирилла и Мефодия, учителей словенских. Под храмом была создана крипта с 75 местами для захоронений. В 1942 г. в крипте храма в течение 22 дней укрывались чешские парашютисты, совершившие покушение на обергруппенфюрера СС Рейнгарда Гейдриха. После того как место их укрытия было обнаружено немцами, епископ Горазд, священники кафедрального собора Вацлав Чикл и Владимир Петршик, а также староста храма Ян Сонневенд были взяты под стражу и 4 сентября 1942 г. расстреляны на военном стрельбище в Праге. 27 сентября было запрещено существование Чешской Православной Церкви. Храм святых Кирилла и Мефодия был закрыт. После восстановления Чешской Православной Церкви в 1945 г. храм был вновь открыт. С 1951 г. он является митрополичьим кафедральным собором Чехословацкой Православной Церкви. В крипте храма действует мемориал памяти жертв гейдрихианы. В соборе также хранятся облачения и личные вещи святого новомученика Горазда.
